——摘自：2004年美國《生命科學》雜志

 魯慶榮   芩信棠   周永昌

香港大學醫(yī)學中心瑪麗皇后醫(yī)院外科系

香港薄扶林道

摘要：

       研究了復方中藥珠香丸對MDA-MB-231乳腺癌細胞和正常人乳腺細胞生長曲線。用WST-1法測定了珠香丸、表阿霉素、5-氟尿嘧啶和環(huán)磷酰胺對細胞增殖的抑制作用。應用流式細胞儀和原位調亡標記試劑盒，以TUNEL技術測定DNA斷裂的方法研究了凋亡作用。增殖指數(shù)和細胞周期的變化分別以Ki-67和碘丙啶作為批示劑用流式細胞儀測定。結果表明珠香丸有明顯的抑制細胞增殖作用并與劑量相關。珠香丸的抑制作用大于常用的細胞毒藥物。誘導細胞凋亡而形成的抑制作用依濃度和時間而變化。統(tǒng)計學處理表明對DNA主要作用于細胞的S期。用ATP生物熒光法測定乳腺癌細胞的活力表明珠香丸具有細胞毒作用。三種不同濃度的珠香丸均顯示了抑制實體瘤的增殖作用。珠香丸能有效地抗乳腺癌。

關鍵詞：珠香丸；細胞凋亡；細胞周期；乳腺癌

引言：

       中藥在中國應用很久，雖然主要是中國人應用，而現(xiàn)在也獲得了中國以外的癌癥患者的贊許【11】【25】。為了探索有效的抗癌藥和治療癌癥，已經(jīng)引起研究人員去調查天然藥物用于癌癥的效果。中草藥療法經(jīng)常是無條件贈送的或者是替代療法而不是主流療法。【2】。一般認為中草藥的活性是許多中藥成分以一定比例配合才起到抗癌細胞的作用。中國的臨床經(jīng)驗表明中草藥是有效的，但缺少科學依據(jù)。珠香丸就是這樣一種藥物，其成分為麝香、半枝蓮、黃芪、珍珠、莪術、當歸、甘草等。已有報導上述單個草藥或混合應用可能有誘導細胞凋亡作用【7】【12】【16】。最近報導用WST-1四氮唑比色法評估抑制細胞生長作用。或用三磷酸腺苷生物熒光法檢測細胞代謝率【17】【10】。無論如何凋亡作用需要用原位凋亡標記技術和“末端脫氧核酸轉移酶dUTP缺口末端標記法（TUNEL）”試驗以證實DNA斷裂。【16】【5】。三磷酸腺苷生物熒光法可檢驗藥物對乳腺實體癌的作用。珠香丸是復方中草藥制劑，用于治療乳腺癌。但在醫(yī)學文獻中尚未見藥理研究報導，本研究依據(jù)細胞生長曲線和對實體癌的作用證實珠香丸具有抗乳腺癌的作用。

材料與方法：

       珠香丸試樣制備：珠香丸由中國長春市抗癌藥物研究所提供。系由麝香、半枝蓮、黃芪、珍珠、莪術、當歸、甘草等經(jīng)提取濃縮精制而成的丸劑。經(jīng)過香港有關部門檢驗，證實其重金屬和微生物限度符合國際安全標準，并未檢出微生物。為了更好地保證實驗質量，取珠香丸50g用甲醇500ml提取三次后，殘渣以二甲亞砜溶解，濃度為100mg/ml，并于4℃保存。臨用時以Hank’s Balanced溶解（卡爾斯巴德爾鹽，美國，加利福利亞Invitrogen公司）稀釋成10mg/ml，用0.22醋酸纖維膜（美國，紐約，Corning公司）濾過除菌。

WST-1法測珠香丸、表阿霉素、環(huán)磷酰胺、5-FU對增生率的影響：

       細胞增生率測定試劑：WST-1，德國曼赫姆，羅克公司。

       MDA-MB-231乳腺癌細胞：美國 Manassas VA的Type培養(yǎng)集團公司

       96孔微生物培養(yǎng)板：美國Massachusetts的Costar公司

       每孔中加入4000個細胞，用Leiboritz氏L-15培養(yǎng)基加10%FBS，于含95%空氣的二氧化碳中37℃培養(yǎng)。珠香丸連續(xù)稀釋為8種不同濃度，于24小時后，每孔加200μl。分別于接種1、3、5、7天后，每孔中加10μlWST-1，于37℃培養(yǎng)1小時。用血小板計數(shù)儀（美國，VT，Winooski的Bio-Tek儀器公司）。在450nm波長下讀取光密度。以同法得出臨床上常用的5-FU(0.5ug/ml),表阿霉素(50ng/ml)和環(huán)磷酸酰胺(0.5ug/ml)的數(shù)據(jù)。

珠香丸對正常人細胞的毒性試驗：

       正常人細胞用的是正常人乳腺細胞CRL7366(美國ATCC提供)。用96孔培養(yǎng)板，每孔放4000個細胞，用Dulbecco氏方法，Eagle氏培養(yǎng)基加10%FBS于含95%空氣的二氧化碳中，37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)方法與細胞毒的檢測方法與上述MDA-MB-231癌細胞生長曲線相似。

用DNA斷裂檢測法測定細胞凋亡：

       將1×106個細胞置于100×15㎜培養(yǎng)皿中，按前述同樣條件培養(yǎng)。細胞凋亡測定應用DNA梯試劑盒（德國羅克公司）。在指定時間用1mg/ml，2mg/ml和4mg/ml的珠香丸作用于細胞。在取樣日，以胰酶處理，并用磷酸緩沖液洗滌。經(jīng)1000轉離心10分鐘后，以濾柱分離細胞的DNA，并以緩沖液洗脫DNA于1.5ml試管中。將帶有不同組DNA的緩沖液，加于2%瓊脂糖的樣品膠帶，膠帶槽加TBE緩沖劑（美國加州Invitrogen公司）以80伏電泳1小時。應用膠帶文件系統(tǒng)（美國勃蘭德的UVP公司）以紫外光顯影檢測DNA梯。

凋亡標記方法：

       將乳腺癌細胞接種于無菌的孔徑12㎜的24孔培養(yǎng)板（美國Coming公司）。每孔105個細胞。珠香丸以4mg/ml，2mg/ml和1mg/ml的劑量加于含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中，并加入孔中。空白用同樣的培養(yǎng)基24小時。于加藥后第1、3、5、7日用2%多聚甲醛固定細胞。應用原位標記凋亡測定試劑盒（美國Intergen公司）檢測細胞凋亡。應用美國Roper Scientific公司的Coolsnap系統(tǒng)和描繪儀（美國Metamorph-Winshell, Universal Imaging公司）分析各組試驗數(shù)據(jù)。

流式細胞儀分析：

       細胞增殖，細胞周期中細胞分布和凋亡百分率應用TUNEL法（末端脫氧核酸轉移酶dUTP缺口末端標記法）經(jīng)XL-MCL流式細胞儀（美國，邁阿密Coulter公司）測得。乳腺癌細胞按前述同樣的條件培養(yǎng)于100㎜2的培養(yǎng)皿，每皿106個細胞。空白及加珠香丸（濃度1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml），在規(guī)定時間收集，固定，并用Ki-67（美國，邁阿密Immunotech公司）和碘丙啶（美國Sigma公司）染色，在細胞周期的不同階段測定細胞的增生與分布。另一方面，用MEBSTAIN凋亡試劑盒（美國，邁阿密Coulter公司）檢測凋亡情況，并應用該公司的Mod Fit軟件分析數(shù)據(jù)。

應用三磷酸腺苷生物熒光法檢測人實體瘤：

       研究分為四組，珠香丸濃度分別為空白組和1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml組。取1㎜3的人乳腺實體瘤，分別置于6孔板中，培養(yǎng)24小時。珠香丸組加入D-MEM/F-12(加15%胎牛血清的Dulbecco’s改良培養(yǎng)基)，15ml HEPES緩沖液，L-谷酰胺，鹽酸VB6,青霉素（100U/ml），鏈霉素（100μg/ml），和胰島素（4μg/ml）。再以24小時為周期培養(yǎng)，收獲日加緩沖液溶解細胞，用超聲器加速溶解，以增加ATP的釋放。于420nm波長以TD-20/20型熒光計（美國加州Turner Designs公司）讀取吸收值。熒光光密度指示三磷酸腺苷量。

統(tǒng)計分析：

       試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計學意義應用SPSS(11,USA)One-Way ANOVA分析。

結果：

 WST-1 四氮唑比色法分析：

       珠香丸、表阿霉素、環(huán)磷酰胺、5-FU對增殖率的影響通過平均光密度測得（表1）。在標定的日期內珠香丸組與對照組無顯著差異。

 凋亡百分率：

      隨著使用珠香丸劑量的增加，細胞數(shù)顯著地減少（P＜0.05）。在第三天抑制作用很顯著，1mg/ml  P=0.007；2mg/ml  P=0.05；4mg/ml  P＜0.001。圖1表示凋亡之百分率，圖2表示增殖率。珠香丸4mg/ml劑量時所有時間點均具有顯著的統(tǒng)計學意義

圖1：珠香丸的細胞凋亡指數(shù)隨其劑量增加而遞增

圖2：珠香丸對細胞增殖率的影響；不同濃度間無顯著差異。

細胞增殖率：

表2表明在S期，1mg/ml，2mg/ml和4mg/ml的珠香丸作用3天，平均細胞增殖率有顯著差異。在4mg/ml的珠香丸作用下，細胞增殖在G1和S期受到阻礙。增殖率有顯著差異。

珠香丸和常用細胞毒藥物的比較：

       圖3表明珠香丸、5-FU、表阿霉素和環(huán)磷酰胺在抑制氧50%時的濃度分別為2mg/ml、0.5ug/ml、50ng/ml和0.5ug/ml。珠香丸的抑制作用顯著大于所試驗的細胞毒藥物（P＜0.005）。也與細胞毒藥物聯(lián)合應用有顯著差異（P＜0.005）。

圖3 珠香丸與常用細胞毒藥物抑制細胞增生作用的比較。珠香丸的抑制作用顯著大于單獨或聯(lián)合使用的5-FU、表阿霉素和環(huán)磷酰胺。

應用三磷酸腺苷生物熒光法檢測人實體瘤：

       在用不同濃度的珠香丸抑制人實體瘤24小時后，測定ATP量與對照組有顯著差異，但與劑量間無比例關系。

圖4  2mg/ml珠香丸誘導MDA-MB-231細胞凋亡

（應用原位凋亡試劑盒測取）

圖5  珠香丸作用3天對DNA斷裂的影響：

1.bpDNA梯   2.對照   3.珠香丸1mg/ml   4.珠香丸2mg/ml

討論

     許多研究者認為復方中藥沒有直接細胞毒作用，【9】抗癌中藥的特點與巨噬細胞有關，通過細胞質變化而體現(xiàn)細胞毒作用。【6】我們的研究表明珠香丸能夠抑制乳腺癌細胞，其抑制細胞生長類似于細胞毒藥物，但對正常細胞生長曲線沒有特別作用。細胞毒藥物是通過誘導細胞凋亡而發(fā)揮其作用的。【4】本研究通過DNA斷裂實驗和TUNEL測定表明珠香丸能誘導凋亡乳腺癌細胞。【3】【19】有趣的是誘導指數(shù)因珠香丸劑量增加而增加，但增殖指數(shù)與對照組無甚差別。所以珠香丸可能通過誘導細胞凋亡起作用，這是和一些報導一致的。【13】【22】細胞周期的研究表明珠香丸集中作用于S期，提示珠香丸是影響細胞周期的抗癌藥。研究結果進一步表明其作用與濃度和時間有依賴性關系。珠香丸明顯作用于S期，對DNA作用大于RNA。【14】不像其他天然藥物，如大豆提取物作用于G2-M期。珠香丸的作用類似于常用阻礙S期的細胞毒藥物。【21】【27】【23】通過DNA斷裂試驗和TUNEL試驗均證明了表阿霉素、5-FU和環(huán)磷酸酰胺的誘導細胞凋亡作用。【26】【8】【18】【1】【24】臨床試驗表明聯(lián)合用上述藥物治療乳腺癌有效。【20】【15】本研究通過上述兩種試驗表明珠香丸與這些細胞毒藥物一樣有致癌細胞凋亡作用。（圖4和圖5）一期臨床試驗已經(jīng)在中國長春完成。

     細胞毒藥物常以靜脈給藥，經(jīng)常發(fā)生不良副作用。而中草藥如珠香丸則未見報導。因細胞毒藥物為單一化合物，故很容易進行作用機制的研究。而復方中藥含有很多潛在的活性組分，這些不同活性物質按一定比例混合才起作用。我們實驗結果提示珠香丸可以作為有效的抗癌劑。因為它們是協(xié)同作用。珠香丸的作用很易重復和有根據(jù)證明。簡而言之，我們認為珠香丸因阻礙S期而抑制乳腺癌細胞生長。它誘導乳腺癌細胞凋亡作用與其它細胞毒化療藥類似。除此以外，珠香丸可以降低乳腺癌患者實體瘤的代謝率。分子水平的研究有待進一步探索。

參考文獻：

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（香港大學醫(yī)學中心瑪麗皇后醫(yī)院外科系 魯慶榮 芩信棠 周永昌）

于2004年